| 發(fā)布日期： 2010-02-22 | 小 | 中 | 大 | 【關(guān)閉窗口】 |
|
1.2.1 心康片對缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究 采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV－304（引自美國組織培養(yǎng)庫ATCC CRI-1998），在Marcy-Etoile 公司缺氧裝置系統(tǒng)中建立體外細(xì)胞缺氧模型，心康片設(shè)置三個(gè)濃度作用于ECV－304細(xì)胞，細(xì)胞在缺氧條件下培養(yǎng)48h。 結(jié)果表明：從形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞儀檢測及DNA電泳三種方法，均可顯示該藥能夠明顯抑制缺血所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；減少缺氧條件下MDA的生成和LDH的釋放并能提高SOD活力。以上研究結(jié)果表明心康片具有保護(hù)缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用，其作用機(jī)制與抗凋亡、抗脂質(zhì)過氧化及提高SOD活力有關(guān)。 1.2.2 心康片對缺氧誘導(dǎo)的大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子、細(xì)胞存活、凋亡通路變化的影響 ① 心康片對大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響 采用原代大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMVECs）培養(yǎng)模型，采用法國BioMerieux○Rsa公司缺氧裝置系統(tǒng)，心康片在三個(gè)濃度下，與CMVECs細(xì)胞共孵育，缺氧條件下培養(yǎng)24小時(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：心康片可顯著抑制缺氧所致的大鼠CMVECs減少；顯著抑制由缺氧所致的線粒體膜電位的下降，提示該藥對缺氧損傷的大鼠CMVECs的保護(hù)作用可能是通過改善線粒體功能來達(dá)到。 ② 心康片對缺氧誘導(dǎo)大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子信號通路變化的影響。 采用上述大鼠CMVECs缺氧模型，心康片在三個(gè)濃度下與細(xì)胞共孵育。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與正常對照組細(xì)胞相比，心康片中、高劑量組能顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的大鼠CMVECs中p38MAPK及其下游蛋白HSP27的表達(dá)，繼而降低細(xì)胞間粘附分子VCAM-1及ICAM-1的表達(dá)；另外心康片各劑量組均能明顯減少CMVECs細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NFκB的表達(dá)，從而抑制缺血所致的細(xì)胞凋亡。提示該藥物可有效抑制缺血時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)過程，進(jìn)而對心肌損傷起到保護(hù)作用。 ③ 心康片對缺氧引起的大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活、凋亡通路的影響 采用上述大鼠CMVECs缺氧模型，心康片在三個(gè)濃度下與細(xì)胞共孵育。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)檢測了MAPK的其它兩個(gè)成員ERK1/2及JNK的表達(dá)。通常情況下，ERK1/2與細(xì)胞分裂增殖密切相關(guān)，而JNK誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與正常對照組比較，心康片中、高劑量能顯著促進(jìn)ERK1/2的表達(dá)，降低JNK的表達(dá)。各劑量對癌基因c-fos的表達(dá)無明顯影響，能顯著降低由于缺氧所致的癌基因c-jun表達(dá)升高。PI(3)K-Akt-eNOS通路與細(xì)胞存活密切相關(guān)。與正常對照組比較，缺氧模型組表達(dá)Akt及eNOS顯著下降。中、高劑量組均能顯著升高Akt、eNOS的表達(dá)；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）與多種心臟疾患有關(guān)，與正常對照組比較，各劑量組均能降低缺氧誘導(dǎo)大鼠CMVECs表達(dá)iNOS。 以上試驗(yàn)結(jié)果提示，心康片通過激活PI(3)K-Akt-eNOS細(xì)胞存活通路，抑制c-jun以及iNOS表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡，；另外可對抗心肌缺血時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)過程與細(xì)胞凋亡。 小結(jié)：心康片抗心肌缺血的作用機(jī)理為： （1）抑制缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，改善線粒體能量代謝； （2）抑制缺血時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)過程，從而減輕心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性損傷。 2. 一般藥理研究 2.1 心康片對正常小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響 設(shè)置三個(gè)劑量組，考察心康片對小鼠自主活動、協(xié)調(diào)運(yùn)動、戊巴比妥鈉閾下劑量協(xié)同催眠時(shí)間等的影響，研究藥物對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響； 試驗(yàn)結(jié)果：心康片三個(gè)劑量對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)均未見影響 2.2 心康片對麻醉犬呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的影響 設(shè)置三個(gè)劑量組，檢測心康片對Beagle犬呼吸頻率、呼吸深度、收縮壓、舒張壓、平均動脈壓及心電圖各項(xiàng)指標(biāo)的影響，來反映藥物對呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的安全性。 試驗(yàn)結(jié)果：心康片三個(gè)劑量對麻醉犬呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)均未見影響。 3. 普通毒理學(xué)研究 3.1急性毒性試驗(yàn) ① 心康片灌胃給藥對小鼠的最大給藥量為6g/kg/天，藥后連續(xù)觀察14天，小鼠各系統(tǒng)均未出現(xiàn)異常表現(xiàn)，臟器取材肉眼未見明顯異常。 ② 心康片灌胃給予大鼠4g/kg/天，藥后連續(xù)觀察14天，大鼠各系統(tǒng)均未出現(xiàn)異常表現(xiàn)，臟器取材肉眼未見明顯異常。 ③ 心康片灌胃給予犬2g/kg/天，藥后連續(xù)觀察14天。犬各系統(tǒng)均未出現(xiàn)異常表現(xiàn)，臟器取材肉眼未見明顯異常。 小結(jié)：根據(jù)以上急性毒性試驗(yàn)的研究結(jié)果，初步認(rèn)為心康片安全性較好。 4. 特殊毒理研究 4.1 心康片致突變作用研究 ① 心康片致鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn) 采用5個(gè)組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌株TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535，設(shè)置空白對照組、溶劑對照組（DMSO 20μl/皿）、陽性對照組、心康片5個(gè)濃度組，分別在±S9mix條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果：心康片各劑量組均沒有誘發(fā)上述五個(gè)菌株回變菌落數(shù)超過對照值2倍的情況，為陰性結(jié)果。 ② 心康片致中國倉鼠肺纖維細(xì)胞（CHL）染色體畸變試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)設(shè)置細(xì)胞對照組、溶劑對照組（2% DMSO）、陽性藥對照組，供試品共設(shè)三個(gè)濃度，檢測藥物在單獨(dú)作用于CHL細(xì)胞和與S9 共同作用于CHL細(xì)胞24h后細(xì)胞染色體的畸變率。 結(jié)果: 根據(jù)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：直接陽性藥、間接陽性藥具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并有可重復(fù)性的陽性反應(yīng)，因此，可判定直接陽性、間接陽性藥在本試驗(yàn)系統(tǒng)中具有致突變性，供試品心康片各劑量組在±S9mix條件均未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并沒有劑量關(guān)系，為陰性結(jié)果。 結(jié)論：在本試驗(yàn)條件下，心康片不引起培養(yǎng)的哺乳動物體細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)畸變。 ③ 心康片致小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核形成試驗(yàn) 以昆明種雄性成熟小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，設(shè)置空白對照組、溶劑對照組、陽性對照組和心康片低、中、高三個(gè)劑量組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，陽性對照組單次經(jīng)腹腔注射給藥，除高劑量組外其余各組單次灌胃給藥，高劑量組兩次給藥，給藥后24h、48h采樣檢查小鼠股骨骨髓微核。 結(jié)果：溶劑對照組股骨骨髓的微核檢查結(jié)果與正常組比較無明顯差異,陽性組股骨骨髓的微核檢查結(jié)果與溶劑對照組明顯增加（P＜0.001），說明陽性組腹腔給藥誘發(fā)雄性昆明種小鼠骨髓微核的作用，實(shí)驗(yàn)方法成功。心康片各劑量組股骨骨髓的微核檢查結(jié)果與溶劑對照組無明顯差異。 結(jié)論：心康片對昆明種雄性小鼠沒有誘發(fā)骨髓微核的效應(yīng)。 小結(jié)：通過以上特殊毒理學(xué)試驗(yàn)研究，進(jìn)一步表明心康片安全性較好。 | ||
